雞傳染性鼻炎研究進展
雞傳染性鼻炎(IC)由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)引起的一種雞的急性上呼吸道疾病,以流鼻涕、打噴嚏、眶下竇腫脹以及臉部水腫為特征。該病導致的最大損失是育成雞生長不良和產蛋雞產蛋率下將(10%~40%)。另外有報道顯示,該病也會對肉雞產生重大的不利影響。在加利福尼亞發生的兩例肉雞發生傳染性鼻炎導致淘汰率升高8%~15%之間,從而給養雞業帶來巨大的經濟損失。
Beach最早于1920年報道該病,1931年,由De Blieck首次分離出該病的致病菌,并命名為雞嗜血紅蛋白鼻炎芽孢桿菌。在1974年正式命名為副雞嗜血桿菌,Blackall于2005年后又將其命名為副雞禽桿菌,該病在世界范圍內流行。
馮文達于1987年首次在北京分離出一株A型致病菌。林毅等于1995年在一個發病蛋雞場分離到A和C型菌。張惠玲、苗得園等于2003年和2005年分離出B血清型副雞禽桿菌,說明在我國該病的各個血清型都存在流行?,F將該病綜述如下。
a/ 細菌形態和培養特性
副雞禽桿菌是一種革蘭氏陰性、無運動性的細小桿菌,長1~3μm、寬0.4~0.8μm,兩極濃染、無芽孢。強毒力的副雞禽桿菌有莢膜,在體外傳代培養易喪失。該菌在普通培養基上不能生長,需用鮮血瓊脂培養基,還需要在培養基中添加滅菌的雞血清和NAD,但也有對NAD非依賴性的菌株在南非和墨西哥被分離出。細菌的質粒決定了這種對NAD的非依賴性。在固體培養基上,副雞禽桿菌的菌體形態規則,明顯的小桿菌狀,但是在液體培養基和老齡培養物中,在形態上該菌會發生變化,主要表現為不規則的形態。
副雞禽桿菌是兼性厭氧菌,需要厭氧環境或者5%的CO2的環境,但對其生長而言,CO2并非必須。其生長24h后,會形成針尖大小,直徑約0.3mm,圓形、露滴狀、透明凸起的菌落。在45°斜射光下,強毒力菌株的菌落能看到偏藍色光,在培養基上傳代培養后偏藍色熒光會消失,菌落也會變得粗糙。除NAD非依賴性副雞禽桿菌外,在鮮血瓊脂培養基上,副雞禽桿菌和飼養菌(生長過程中可生產NADH的細菌,如表皮或者金黃色葡萄球菌)交叉劃線,會出現衛星現象。
副雞禽桿菌最佳培養溫度是37~38℃,適宜的pH范圍是6.9~7.6之間。另外,氯化鈉是副雞禽桿菌生長必須的營養素,濃度要求是1.0%~1.5%。副雞禽桿菌的生化特性有其特殊性,可以用來鑒定分離菌。例如其可以分解葡萄糖, 但對蔗糖的分解能力有差異, 不能分解阿拉伯膠糖、海藻糖等; 過氧化物酶、鳥氨酸 脫羧酶反應陰性,半乳糖苷酶反應陽性;靛基質試驗、尿素酶試驗、 H2S試驗以及明膠液化試驗均為陰性。其具體生化和培養特征如表1- 1所示。
表 1-1 副雞禽桿菌生化特性鑒定表
備注: “+”表示可分解利用; “- ”表示不可分解利用;“V”表示可變。
b/ 抵抗力
副雞禽桿菌對外界環境抵抗力小,離開宿主后會很快死亡。在不同的保存介質中保存時間有顯著的差異,例如-80℃凍干卵黃可保存10年以上。在其余的保存介質和條件下,-70℃可保存數年,-2℃可存活3個月,在4℃培養基中也只能存活幾天,室溫下干脫脂棉球上可存活數天,22℃生理鹽水中存活24小時,在自來水中存活4小時。
副雞禽桿菌對理化因素的抵抗力也很弱。例如其對pH的變化很敏感,低于6.9或高于7.6會抑制其生長直至不生長,在4℃,0.25%的福爾馬林溶液中24h即可殺死,在0.01%的硫柳汞溶液中1周也可將其滅活。在體外試驗時,副雞禽桿菌對氨芐青霉素、磺胺嘧啶、紅霉素、氟苯尼考、卡那霉素、恩諾沙星等抗微生物藥敏感,但有對一些抗菌藥物耐藥的菌株出現,這也是臨床上使用藥物治療效果不好的主要原因。
c/抗原性和免疫原性
Page將其掌握的副雞禽桿菌使用全細胞平板凝集試驗分為A、B和C三個血清型,也使用了血凝抑制(HI)試驗對這些分離株進行分型,但是仍有部分分離株不能有效的分型。Kume等建立了另一種血清學分類方法,將副雞禽桿菌分為A、B、C三個血清群,與Page血清型A、B、C相匹配。三個血清群又細分為9個血清型,分別是A- 1至A-4、B- 1、C- 1至C-4。
在免疫原性方面, 副雞禽桿菌菌苗與普通細菌比較具有其相對獨特的特性。用一種血清型制備的菌苗免疫雞只能保護同源菌的攻毒,不同的菌株的免疫原性不一樣,A、B 、C型滅活苗之間的交叉保護弱, 同一血清型各個亞型之間的交叉保護也有差異,且有研究表明在Page血清B型內只有部分交叉保護。
目前已完成了Kume血清型9個副雞禽桿菌參考菌株之間的交叉保護研究,其結果顯示在A型血清群中,A- 1、A-2和A-3之間以及A- 1和A-4之間具有很好的交叉保護,對于他們之間的相互攻擊都能夠提供很好的保護;在C血清型中,C- 1、C-2和C-3有很好的交叉保護,例如對于C- 1的攻擊C- 1、C-2和C-3都能夠提供很強的交叉保護。在研究中也發現同源血清群攻擊同源血清群其保護效果要優于攻擊異源血清群的保護效果。該研究顯示,A、B、C血清群之間的免疫關系相距較遠。在Kume方案的B血清群中只有一個血清型,即B- 1,但是已有的B血清群中也發現未被確認的其他型。此外,因為血清B型分離株之間只有部分交叉保護,可能也預示著B血清群仍存在其他血清亞型。
d/致病性及毒力因子
副雞禽桿菌的致病性隨著分離株的傳代、宿主狀態的變化而變化,且有證據表明,部分副雞禽桿菌分離株致病性存在變異。Kume血清型參考株中的A- 1,A-4,C- 1,C-2和C-3表現出比A-2,A-3,C- 1,B- 1和C-4更強的致病性。Horner等指出NAD非依賴性分離株引起的氣囊炎比經典株更常見,但有試驗表明南非NAD依賴性分離株較非依賴性分離株具有更強的毒性,且毒力足以引起免疫雞只表現出臨床癥狀,這也解釋了部分免疫雞群仍然會感染傳染性鼻炎并發病。
國內有研究人員使用 SPF 雞研究了A、B和C型3種血清型的致病力,結果顯示,A、B和C型副雞禽桿菌對SPF雞均有很強的致病力。Zhao Qin等使用30日齡的普通雞進行了A、B和C型三株菌的致病力試驗,其中A型和B型菌株毒力相差不大,C型菌株毒力相對較弱,但其臨床癥狀相似,面部水腫、結膜炎、漿液性或粘液性鼻分泌物,且隨著攻毒劑量的增加,發病率增加。另外也有研究表明B型副雞禽桿菌有較強的致病性。
多個因素決定了副雞禽桿菌的致病性。血凝素抗原是其主要的毒力因子之一。研究者通過使用缺少血凝素活性的變異株,研究證明血凝素抗原是決定副雞禽桿菌免疫原性和致病性的關鍵因素。Wang Yi Ping等研究發現副雞禽桿菌的主要血凝素抗原是稱為HMTp210的外膜蛋白,也證明其在粘附于宿主細胞表面過程中起主要作用。Yuan-Man Hsu等分析了臺灣A9分離株的功能性重組血凝素蛋白的免疫原性,發現其亞單位疫苗免疫保護率可達71%。也有研究者采用原核表達出副雞禽桿菌的重組血凝素抗原,免疫雞群后可以產生相應的抗體,但其免疫保護力不足。
莢膜是細菌的表面結構之一,也可用于鑒別細菌。副雞禽桿菌的莢膜多糖含量可以通過苯酚-硫酸法進行測定。有試驗顯示,每升菌液可以提取得到莢膜多糖85mg;通過高效液相色譜可以分析出莢膜多糖主要是由D-木糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖等組成。細菌定植過程中莢膜也起到一定作用,并引起雞傳染性鼻炎主要的病變。副雞禽桿菌的莢膜可以保護細菌抵抗正常雞血清的殺細菌活性。也有研究者提出有莢膜的細菌釋放的毒素導致了相關臨床癥狀。有研究表明,使用莢膜多糖和血凝素兩種抗原制成的疫苗要比兩者單獨使用的效果要好,對強毒攻擊的保護率可達到80%。
細菌內散在的質??赡芎信c毒力相關的基因。2013年,有學者發現并報道了一種新的毒力因子AvxA,它編碼的RTX毒素對雞的巨噬細胞系HD11有細胞毒性,且所有血清型的副雞禽桿菌都有該毒力因子。
副雞禽桿菌可以感染各個年齡段的雞,但是幼齡雞一般不太嚴重?;痣u、鴿子、麻雀、鴨、鵝對其有抵抗力。副雞禽桿菌不能通過垂直傳播, 只能通過水平傳播。 其在上呼吸道內增殖, 然后通過鼻汁和眼淚排出體外。冬、春等氣候多變季節易發生,原因是溫度低, 通風量減小, 有害氣體(主要是氨氣) 濃度增大, 氣候干燥, 灰塵多等原因導致呼吸道粘膜受損從而誘發該病。
世界多數國家地區的養雞地區都有本病的發生,更是集約化養雞場種的一種常見問題。但流行的副雞禽桿菌菌型不盡相同,在西班牙分出 A、B和C型;在澳大利亞、印度尼西亞分出A和C型;在馬來西亞分出A型。我國副雞禽桿菌各個血清型的流行情況也存在動態變化。在2001年以前分離得到的許多副雞禽桿菌主要是A型,顯示A型菌株的流占主導地位。在2003年,張培君等在遼寧首次分離到B型副雞禽桿菌,同年孫惠玲等在北京一種雞場也分離出B型分離株,顯示B型株在國內有流行;2006年,苗得園等從不同地區免疫失敗的雞場分離到15株為A型,4株為B型。
另外有證據表明雞群發生傳染性鼻炎不僅僅是免疫失敗,還有可能是B型株導致。大日齡的蛋雞或者種雞較肉雞多發,晝夜溫差大的冬春季較夏季多發。2012年,路迎迎等首次在安徽蛋雞場分離出B型株。2015年,趙國生等從全國各地送檢病雞中分離到A型10株、B型63株、C型4株。2017年,龔玉梅等從北京、山東、安徽、貴州、河北和廣西的大中型養殖企業發生疑似雞傳染性鼻炎病例的125份病料中分離出45株副雞禽桿菌,其中B型為30株,占66.7%;A型為15株,占33.3%,暫時沒有檢測到C型。以上研究報道顯示B型株導致的雞傳染性鼻炎比例趨多。
a/臨床癥狀
感染副雞禽桿菌后1~2天可出現相關臨床癥狀。主要的臨床癥狀是精神沉郁、眶下竇以及肉髯腫脹、咳嗽等。由于鼻孔流出漿液性或者粘液性分泌物導致鼻孔周圍粘附大量的墊料或者雞毛。部分雞腹瀉排除稀便,采食、飲水量降低,嚴重的雞群由于眼睛腫脹不能睜開,導致水料廢絕。病程長的會導致淘汰率增加、產蛋率下降,當繼發其他致病菌感染會導致死亡率大量增加, 例如和雞毒支原體、傳染性支氣管炎、低致病性禽流感、傳染性喉氣管炎并發時,會導致癥狀加重、死亡率增加。肉雞發生該病時會引起肉質下降和死淘率增加。
b/病理變化
副雞禽桿菌能夠導致鼻腔和眶下竇呈卡他性炎癥,眶下竇腔內有粘液性到膿性分泌物,嚴重病例可見黃白色干酪物;喉頭有粘液性分泌物,粘膜腫脹呈紅色,氣管出血,管腔內有痰樣咳出物,偶有肺炎及氣囊炎。頭面部皮下水腫,眼瞼內大量膿性或者黃白色干酪樣滲出物。上呼吸道粘膜和相關的腺上皮細胞會脫落、裂解或者增生,在粘膜固有層中出現充血和水腫,伴有肥大細胞浸潤,導致血管和細胞損傷。
a/臨床診斷
在臨床診斷中可以根據發病急、傳播速度快、頭部特別是眶下竇區域腫脹、鼻孔周圍粘附大量的墊料和雞毛即可做出初診。另外,由于傳染性鼻炎發病雞日齡和易感性的不同、菌株毒力的差異以及其它病原的混合感染等因素,使本病在臨床上的診斷變得復雜。因此,需要進一步的實驗室確診。
b/病原分離和初步鑒定
病原的分離與鑒定是雞傳染性鼻炎的基本診斷方法。將病料在不含NAD的血瓊脂平板上與飼養菌(表皮葡萄球菌)交叉劃線,在5%CO2培養箱中37℃培養24h后觀察其菌落分布特點,有無出現衛星現象,進而判斷有無副雞禽桿菌。也可將分離菌接種到細菌微量生化鑒定管中進行生化鑒定,如果分離菌的生化特性和副雞禽桿菌一致,也可做出診斷。將分離菌的培養物接種易感雞(無副雞禽桿菌抗體),做動物攻毒試驗也可用來診斷。
c/血清學方法
可用于檢測副雞禽桿菌的血清學方法有瓊脂擴散試驗(AGP)、平板凝集試驗(SPA)、血凝抑制試驗(HI),以及近期發展出的Dot-Elisa、間接Elisa、夾心Elisa和阻斷Elisa等方法。其中 AGP和SPA方法簡便,但其準確性較其他方法低。HI方法能夠檢測雞群抗體變化情況,然后根據抗體滴度大小來評價免疫效果。Elisa方法操作復雜、成本高但其敏感性和特異性好。陳小玲等證實,間接Elisa的敏感性和特異性比HI方法高9.4%。張培君等運用Dot-Elisa,血清抗體的檢出率為 80%。2009年,豈曉鑫建立了一種具有較好的特異性和敏感性的檢測A型副雞禽桿菌的夾心 Elisa方法。2007年,張文文建立了一種操作簡便、特異性好的檢測A型副雞禽桿菌特異性抗體的阻斷Elisa方法。
d/分子生物學方法
PCR方法可以用來檢測副雞禽桿菌。在檢測時,對單個菌落樣品的檢測敏感性可達到104倍稀釋。此外,在檢測臨床病料時,對采樣要求低,死菌活菌皆可。有試驗表明,使用PCR方法對可疑病料的檢出率是細菌分離鑒定方法的2~3倍。因此,PCR在雞傳染性鼻炎的實驗室診斷中發揮了很大的作用,被廣泛采用,但是一般的PCR不能區分血清型。Sakamoto R等利用多重PCR對分離出的副雞禽桿菌進行血清分型,但是由于樣本數量較少,可靠性需要進一步的確認。2001年,宋敏訓等建立一種可以檢測到10個細菌的PCR,其靈敏度遠遠高于常規PCR。2008年,鄧顯文等建立一種能夠檢測副雞禽桿菌的16S rRNA的PCR,其能擴增出282bp的16S rRNA片段,從而可以檢測到最低10pg的副雞禽桿菌DNA。Patil VV等使用16SrRNA測序的方法對印度分離株進行鑒定,結果顯示三個分離株的部分16S rRNA序列與NCBI數據庫參考菌株的同源性為96~99%,驗證該方法是一種準確、靈敏、可靠的分子鑒定診斷工具。
目前已經建立的各種傳染性鼻炎的檢測方法。從總體上可以分為兩類, 一是檢查病原菌或其特異性成分的方法; 在早期診斷時, 檢查病原或其特異性成分的方法優點突出, 能排除滅活苗免疫后產生的抗體的干擾, 還可檢測出健康帶菌動物。二是檢查特異性抗體的方法。檢測血清抗體方法對條件要求較低, 簡便和快速, 因此適應于大量的檢測。另外, 因為抗體持續時間長, 所以可以追蹤前期的疾病狀況, 這在流行病學調查時會更加方便??傊?, 在副雞禽桿菌的鑒定過程中, 應根據現場實際條件和臨床診斷要求,合理選用方法,以便快速、準確地診斷本病。
a/飼養管理和生物安全
規范的飼養管理是雞群健康的保障,按照雞群舒適的要求控制雞舍的內環境,避免大的溫差和相對濕度的變化以及有毒、有害氣體的蓄積(氨氣,二氧化碳等),讓雞群享受相應的動物福利。
病雞、帶菌雞以及污染的飼料、工具等是本病的主要傳染源。加強衛生消毒管理,對畜舍、設備、場區定期進行消毒,特別是進出場區的人員、車輛、物資等一定要嚴格消毒,切斷副雞禽桿菌的傳入到農場內。如果農場發生傳染性鼻炎,應采取嚴格有效的隔離措施,例如安排單人飼養,禁止交叉污染;全面的消毒措施,例如帶雞消毒、場區消毒;及時使用抗生素進行治療;改善管理、消除不良應激,例如氣溫突變、高溫高濕、過分擁擠、有害氣體濃度高等。
b/免疫接種
臨床上使用的雞傳染性鼻炎疫苗主要是滅活疫苗。國內的研究者做了一些疫苗研制的試驗, 取得了一些好的效果。2000年,苗得園等制備雞傳染性鼻炎二價油乳劑滅活疫苗,并做了攻毒保護試驗,結果顯示該苗對A型菌株保護率為100%、對C型菌株保護率為93.3%。2006年,馬爽等制備了傳染性鼻炎氫氧化鋁膠滅活苗,并與進口的雞傳染性鼻炎滅活疫苗同時進行免疫保護試驗, 結果顯示其與進口苗差異不明顯。
2006年,朱士盛等制備雞傳染性鼻炎鋁膠滅活苗和油佐劑苗作對照,結果顯示鋁膠苗比油乳劑滅活苗效果好。2008年,謝春伏等制備雞傳染性鼻炎油乳劑滅活苗,攻毒保護試驗結果顯示保護率大于90%。2010年,龔玉梅等研制雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗,攻毒保護試驗結果顯示疫苗保護率均在80%以上。
國外的研究者對雞傳染性鼻炎疫苗的研究主要集中在佐劑和滅活劑方面。在防腐劑選擇上,硫柳汞對菌苗的效力要優于福爾馬林。在佐劑的選擇上,鋁膠苗和礦物油苗都有效,但礦物油有明顯的副反應。在接種途徑上,腿部注射要優于胸部注射。在接種次數上,兩次接種優于一次接種。
雖然疫苗免疫接種在預防傳染性鼻炎起到重要作用,但有報道A、C型二價滅活疫苗免疫后不能對B型菌提供有效保護,且A、C型HI抗體陽性率、抗體滴度與對B型菌攻毒保護率無相關性。Yamaguchi等發現,不同B型菌株之間只能提供部分交叉保護。有研究發現,即使使用的疫苗包含流行血清型的滅活菌株,但是仍然存在免疫后感染的現象,且分離到了該型的變異株。因此,在選擇和使用疫苗時,最好對本地區流行株進行鑒定以確定血清型和菌株特性,從而選擇相應血清型的疫苗。由于副雞禽桿菌抗原多變性和變異株的出現,疫苗菌株最好選擇免疫原性好的本地分離株。
c/藥物治療
改善雞舍內環境,給雞群提供舒適的生活環境,避免受到冷熱應激及有害氣體的不良刺激。
有效的用藥途徑,肌肉注射效果最好,但在集約化養殖條件下,對雞應激大,人員勞動強度大,不現實。通常選擇飲水給藥的方式。
敏感性藥物的選擇,用藥時可選擇2~3種有效藥物配伍使用,以增加治療效果。如副雞禽桿菌對磺胺類敏感、氟喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、抗菌力強等特點,可優先選擇。如華辰制藥的華諾欣(10%恩諾沙星溶液)具有生物利用度高、體內分布合理和穩定的優勢,最傳染性鼻炎的治療具有良好的效果。
劑量和療程。藥物治療最好連用5天,給予足夠的劑量,以保證效果。